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La separazione degli isotopi di un elemento è estremamente difficile da realizzare. Impiegando metodi chimici è impossibile ottenere una separazione totale, dal momento che le caratteristiche chimiche degli isotopi sono quasi identiche. Spesso è dunque necessario ricorrere a metodi fisici, che si basano su ridottissime differenze di proprietà chimico-fisiche, determinate dal diverso numero di massa. Un'altra possibilità consiste nello sfruttare la separazione elettrolitica e le varie procedure di scambio; esse infatti dipendono dalle velocità di reazione o dalle differenze di equilibrio, essenzialmente determinate dalla differenza delle energie di legame chimico, a loro volta funzione delle masse degli isotopi. I primi isotopi a essere separati in quantità apprezzabili furono quelli dell'idrogeno: il deuterio (idrogeno 2) e l'idrogeno 1. Questo risultato fu ottenuto nel 1932 dal chimico statunitense Harold Urey, universalmente considerato lo scopritore del deuterio.
Nel periodo che precedette il 1940 furono sviluppati numerosi metodi di separazione che, sebbene non completamente efficaci, risultarono sufficienti per produrre le piccole quantità di isotopi necessarie nell'ambito della ricerca. I metodi più validi, quali la centrifugazione, la distillazione frazionata, la diffusione termica, l'elettrolisi, la diffusione gassosa e la separazione elettromagnetica, erano basati sulle piccole differenze in peso degli isotopi. È chiaro quindi che si rivelarono molto più efficaci nel caso dell'idrogeno, dove la differenza in peso degli isotopi è del 100%. Per altri isotopi, quali ad esempio il carbonio 12 e il carbonio 13, il neon 20 e il neon 22, o l'uranio 235 e 238, le piccole differenze percentuali in numero di massa riducono considerevolmente l'entità degli effetti osservabili, e rendono molto complessa la separazione. Tutti i metodi, fatta eccezione per quello elettromagnetico, richiedono un'elaborata successione di passaggi. Al termine di ciascuno di questi, la separazione è solo parziale: il materiale originario è diviso in due frazioni, una delle quali contiene una percentuale leggermente maggiore dell'isotopo più pesante e l'altra una percentuale maggiore di quello più leggero. Per ottenere una concentrazione apprezzabile, ovvero un arricchimento dell'isotopo desiderato, è necessario separare ulteriormente la miscela. Questo processo viene generalmente ottenuto grazie a una sequenza di numerose fasi, che procede a cascata: la frazione arricchita prodotta in ciascuna fase diventa il materiale di partenza per la separazione successiva, mentre la frazione scartata, che ancora contiene una considerevole percentuale dell'isotopo desiderato, viene aggiunta al materiale iniziale dello stadio precedente. Le attrezzature progettate per svolgere queste delicate funzioni sono programmate in modo da rendere automatico il passaggio da uno stadio all'altro. L'intero processo è estremamente flessibile, e i diversi passaggi possono anche essere eseguiti in tempi diversi. Nel caso dell'uranio, ad esempio, poiché la quantità di uranio 235 è circa 140 volte minore rispetto a quella dell'isotopo 238, è necessario disporre di un'abbondante quantità di materiale di partenza. Al termine del processo, l'uranio 235 è quasi puro, ma il volume del materiale è di gran lunga minore di quello iniziale. Spesso è allora possibile organizzare l'apparecchio di separazione da uno stadio all'altro, in modo da compensare, con l'aggiunta di nuovo uranio precedentemente arricchito, la progressiva perdita di materiale.
Il metodo della centrifugazione sfrutta la piccola differenza di massa tra i vari isotopi. Il materiale iniziale viene inserito in una sorta di cilindro rotante (vedi Centrifuga), che ha l'effetto di aumentare la concentrazione dell'isotopo più pesante nella regione più esterna del cilindro. Il metodo della distillazione frazionata consiste nel distillare una miscela contenente vari isotopi; le molecole con punto di ebollizione più basso (gli isotopi più leggeri) si concentrano nel flusso di vapore e possono quindi essere raccolte.
Il metodo della diffusione termica sfrutta la tendenza delle molecole più leggere di un liquido o di un gas a concentrarsi nelle zone più calde. Un semplice sistema per la diffusione termica consta di un alto tubo verticale, lungo il cui asse centrale è posto un filo riscaldato elettricamente alla temperatura di 500 °C; questo filo produce un gradiente di temperatura tra il centro e le pareti del tubo. Gli isotopi più pesanti tendono allora a concentrarsi nelle zone più esterne del tubo, quelli più leggeri verso il centro. Inoltre, il gas o il liquido vicino al filo tende a salire, mentre quello più esterno tende a scendere. L'effetto finale è quello di raccogliere gli isotopi più pesanti sul fondo del tubo e quelli più leggeri alla sua sommità.
La separazione elettrolitica fu il primo metodo utilizzato per ottenere deuterio puro: riveste dunque notevole importanza storica e, ancora oggigiorno, pratica. Esso si basa sul fatto che, quando l'acqua subisce elettrolisi, l'isotopo dell'idrogeno più leggero viene prodotto per primo: è possibile quindi ottenere un arricchimento di D2O dell'acqua residua dell'ordine del 99,8%.
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