Reazione a catena della polimerasi

1

Introduzione

Reazione a catena della polimerasi o PCR In biologia molecolare, tecnica mediante la quale un frammento di acido desossiribonucleico (DNA) può essere riprodotto in un gran numero di copie. Tale tecnica fu messa a punto nel 1983 dal biochimico statunitense Kary B. Mullis e dal suo collaboratore Fred A. Faloona presso la Cetus Corporation di Emeryville, California. Mullis, per la sua scoperta, fu insignito nel 1993 del premio Nobel per la chimica.

Al momento della sua scoperta, la PCR (Polimerase Chain Reaction) non sembrava avere una rilevanza pratica; soltanto a partire dal 1991 cominciò a essere utilizzata ed è oggi largamente impiegata nei laboratori di tutto il mondo. La PCR rende più rapido l’ottenimento di copie di un frammento di DNA in esame, che in precedenza veniva affidato alla tecnica della clonazione.

2

Meccanismo della PCR

La reazione a catena della polimerasi si basa sullo stesso meccanismo di duplicazione del DNA che si verifica all’interno delle cellule viventi. La struttura del DNA è formata da due filamenti tra loro complementari; durante il processo di duplicazione, i due filamenti si separano e un enzima specifico, denominato polimerasi, produce una copia di ciascuno, utilizzandolo come stampo. La polimerasi procede appaiando un nucleotide complementare a ogni nucleotide di un filamento; in tal modo si formano due catene di DNA identiche a quella iniziale. Normalmente, il processo si verifica in una cellula durante la mitosi, ossia durante il processo di divisione cellulare che porta alla formazione di due cellule figlie, geneticamente identiche alla madre. Per lo svolgimento della PCR è necessaria la presenza dell’enzima polimerasi, di una riserva di nucleotidi liberi e di un breve filamento di nucleotidi, purificato in laboratorio, che ha la funzione di innescare la reazione e prende il nome di primer o iniziatore oligonucleotidico.

2.1

Fasi di esecuzione

La reazione a catena della polimerasi avviene in tre fasi. Nella prima, denominata denaturazione, il frammento di DNA viene riscaldato a una temperatura di 90-95 °C per 30 secondi, allo scopo di indurre la separazione dei due filamenti complementari che lo compongono. Nella seconda fase, detta annealing o attacco, la temperatura viene mantenuta per 20 secondi a 55 °C, il che determina il legame tra i primers con i due filamenti di DNA. Nella terza fase, la polimerizzazione, la temperatura viene innalzata a 75 °C e la polimerasi copia con grande rapidità il DNA, aggiungendo a ciascun filamento i nucleotidi complementari. Queste tre fasi costituiscono un ciclo della PCR, che si realizza in meno di 2 minuti. Teoricamente, un ciclo potrebbe ripetersi in modo indefinito; in realtà, i nucleotidi liberi, la polimerasi e i primers devono essere rinnovati circa ogni 30 cicli. In 30 cicli, che si svolgono nell’arco di meno di tre ore, si può ottenere un miliardo di molecole di DNA.

2.2

La polimerasi Taq

L’enzima polimerasi, utilizzato nei primi esperimenti della reazione a catena della polimerasi, risultava facilmente degradato dal calore; ciò costringeva i ricercatori ad aggiungere una certa quantità di enzima per ciascun ciclo, in modo da sostituire le molecole enzimatiche inattivatesi nel corso della reazione. Attualmente, i ricercatori dispongono di una versione termostabile della polimerasi denominata Taq che non subisce l’effetto del calore. All’inizio tale enzima veniva estratto da Thermus aquaticus, un batterio termofilo che vive nelle pozze di acqua calda del parco nazionale di Yellowstone. La polimerasi Taq viene attualmente ottenuta in laboratorio da batteri modificati geneticamente (vedi Organismi transgenici). Durante l’esecuzione della PCR è necessario impedire che la miscela di reazione venga contaminata con frammenti di DNA diversi da quelli che si vogliono moltiplicare.