1.

Introduzione

Microscopio Strumento capace di fornire un’immagine ingrandita di un piccolo oggetto osservato attraverso di esso. A seconda della radiazione utilizzata per “illuminare” il campione, si distinguono due tipi principali di microscopio, quello ottico e quello elettronico: nel primo si impiega radiazione visibile (luce), nel secondo un fascio di elettroni accelerati.

Il microscopio ottico fu inventato tra il XVI e il XVII secolo; la sua paternità è controversa, ma la maggior parte delle fonti la attribuisce all’olandese Zacharias Jansen, che avrebbe costruito il primo esemplare nel 1595. Per l’invenzione del microscopio elettronico, invece, che vanta prestazioni di gran lunga superiori a quello ottico, si è dovuto aspettare la messa a punto della tecnologia elettronica: la sua invenzione risale al 1931.

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Potere di ingrandimento e di risoluzione

I principali parametri che caratterizzano un microscopio sono il potere di ingrandimento e il potere di risoluzione. Il primo è definito come il rapporto tra la dimensione dell’immagine ingrandita e quella dell’oggetto osservato. Il secondo è il reciproco della distanza minima tra due punti del campione che lo strumento è in grado di far apparire come distinti; tale distanza, secondo la formula empirica di Ernst Abbe, è data dal prodotto di una costante opportuna per la lunghezza d’onda della radiazione utilizzata. Quindi, per avere una risoluzione migliore, è necessario impiegare radiazione con lunghezza d’onda piccola.

In realtà, esiste un limite intrinseco al potere di risoluzione di un microscopio. Tale limite è posto dal fenomeno della diffrazione, che rende impossibile percepire distintamente un oggetto di dimensioni paragonabili a quelle della lunghezza d’onda della radiazione impiegata.

Si ricorda che anche per il microscopio elettronico si può parlare di lunghezza d’onda, in quanto, in accordo con i principi della meccanica ondulatoria, un fascio di particelle può essere visto come radiazione corpuscolare di lunghezza d’onda pari al rapporto tra la costante di Planck h e la quantità di moto p della particella (λ = h/p).

È proprio per migliorare il potere di risoluzione che è stato ideato il principio della microscopia elettronica e, più tardi, il metodo della scansione, applicato sia alla microscopia elettronica che a quella ottica.

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Microscopio ottico

Il nome completo del microscopio ottico è “microscopio ottico composto” (MOC), denominazione che permette di distinguerlo dal cosiddetto microscopio semplice, lo strumento ottico meglio noto come lente di ingrandimento.

Nella sua forma più essenziale, il microscopio composto è costituito da una combinazione di due lenti convergenti – l’obiettivo e l’oculare – montate a distanza fissa alle estremità di un tubo chiuso. L’obiettivo raccoglie la luce proveniente dal campione e ne fornisce un’immagine reale, capovolta e ingrandita; l’oculare riceve questa immagine nel proprio fuoco e la trasforma nell’immagine finale, che è virtuale, capovolta e ingrandita rispetto all’immagine reale.

Quella descritta è la struttura essenziale del microscopio composto. Va tenuto presente, tuttavia, che nella realtà l’obiettivo e l’oculare non sono singole lenti, ma più complicati sistemi di lenti combinate, che nel complesso producono l’effetto di singole lenti convergenti, prive dei difetti di aberrazione cromatica.

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Strumentazione accessoria

Il tubo che porta l’ottica del microscopio è montato su una struttura chiamata statore. L'attrezzatura accessoria di un microscopio comprende inoltre il piano portacampioni e alcuni dispositivi di regolazione della distanza dell'obiettivo dall'oggetto, per la messa a fuoco. In genere il campione da osservare viene posto fra due vetrini sottili e fissato al portacampioni. La luce che lo illumina può provenire da una sorgente diretta o da uno specchio che la indirizza sul campione. I modelli più sofisticati sono provvisti inoltre di un sistema di viti micrometriche per la regolazione fine della posizione del campione, e di tre o più obiettivi montati su una testa girevole, che consentono di variare rapidamente il potere di ingrandimento dello strumento.

Nel caso in cui il microscopio venga utilizzato per realizzare microfotografie, è predisposto per ospitare l’oculare di una macchina fotografica. Per questa applicazione il sistema è studiato in modo che l’immagine che impressiona l’emulsione fotografica sia reale, e non virtuale. Si utilizza quindi direttamente l’immagine fornita dall’obiettivo che, appunto, è reale, capovolta e ingrandita.

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Illuminazione

Esistono diversi sistemi di illuminazione del campione, a seconda delle sue caratteristiche di trasparenza o opacità. I sistemi più utilizzati sono quello a trasmissione (o a campo chiaro) e a diffusione (o a campo scuro). Nel primo caso, la luce proveniente da una lampada a incandescenza attraversa completamente il campione; nel secondo, colpisce il campione e ne viene diffusa. Più precisamente, nel sistema a diffusione il fascio incide sul campione lungo una direzione quasi perpendicolare all'asse dello strumento, per cui l'obiettivo raccoglie solo la luce diffratta dal campione. Il risultato è che le parti libere del campione appaiono come un fondo scuro su cui risaltano i particolari in esame. La tecnica è particolarmente utile per l’osservazione di campioni biologici limpidi e trasparenti, e per oggetti talmente piccoli da risultare invisibili con il sistema di illuminazione normale.

Nel caso in cui il preparato sia completamente opaco, infine, si adotta un sistema a riflessione, nel quale la radiazione che giunge all’obiettivo è quella riflessa dalla superficie del campione.

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Prestazioni

Il potere di ingrandimento di un microscopio ottico è dato dal prodotto di quello dell’obiettivo per quello dell’oculare. I modelli più sofisticati sono in grado di ingrandire l’immagine del campione fino a circa 1000 volte (1000x). Il potere di risoluzione, invece, è limitato dal fenomeno della diffrazione, e dipende dalla lunghezza d’onda della radiazione impiegata; per la luce bianca, la minima distanza percettibile è di 0,2 micron (0,2 millesimi di millimetro), che equivale a un potere risolutivo 1000 volte migliore di quello dell’occhio umano.

La più alta risoluzione per un microscopio ottico è stata raggiunta da un gruppo di ricercatori statunitensi, che hanno perfezionato una tecnica nota come “microscopia Raman a campo vicino”. La tecnica, applicata a campioni di nanotubi di carbonio, ha reso possibile l’osservazione di strutture delle dimensioni di 30 nanometri. La tecnologia Raman consiste essenzialmente nell’inviare sul campione luce laser e nell’osservare come questo la defletta, misurando i modi vibrazionali delle molecole analizzate; per focalizzare il fascio laser, in questo caso la luce è stata inviata sulla punta di un cavo d’argento di 10 nanometri, quindi utilizzata per esplorare il “vetrino” a 1 nanometro di distanza dalla sua superficie.

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Microscopi ottici per usi particolari

Esistono numerose varianti del microscopio ottico composto, diverse per tecniche di illuminazione, radiazione impiegata, disposizione delle lenti.

Il microscopio stereoscopico è una di queste: è costituito da due microscopi a basso potere di ingrandimento, affiancati e puntati sullo stesso campione. Con questo impianto, sebbene l’ingrandimento non superi le 100 volte, è possibile ottenere immagini tridimensionali. Il microscopio binoculare, invece, reca due oculari in luogo di uno solo. La variante rende più agevole l’osservazione, che può essere effettuata con entrambi gli occhi.

Il microscopio a ultravioletti utilizza radiazione con lunghezza d’onda minore della luce visibile, vale a dire, luce ultravioletta. L’accorgimento produce un aumento del potere di risoluzione, ma impone alcune modifiche: poiché il vetro non è trasparente agli ultravioletti, gli elementi ottici devono essere realizzati con altri materiali, quali quarzo, fluorite o specchi alluminizzati. Essendo gli ultravioletti invisibili all’occhio umano, inoltre, per essere visualizzata, l'immagine deve essere resa per fosforescenza o per scansione elettronica.

Il microscopio polarizzatore è un microscopio ottico corredato di due nicol, di cui uno polarizzatore e uno analizzatore. Viene utilizzato principalmente in mineralogia, per il riconoscimento dei minerali in base alle loro proprietà ottiche. Il prisma polarizzatore è posizionato tra la sorgente luminosa e il campione, l’analizzatore tra l’obiettivo e l’oculare; entrambi sono montati su supporti girevoli e graduati.

Il microscopio a contrasto di fase sfrutta l’interferenza tra la luce diretta proveniente dalla sorgente e quella diffratta dal preparato, per far risaltare meglio i particolari del campione. Un dispositivo di forma anulare riduce l'intensità della luce diffusa e, contemporaneamente, introduce uno sfasamento di un quarto di lunghezza d'onda tra due raggi paralleli incidenti sul campione. Particolarmente indicato per lo studio di tessuti biologici, questo tipo di microscopio trova largo impiego in biologia e in medicina; presenta infatti il vantaggio di non dover ricorrere a colorazioni artificiali, consentendo l’osservazione di preparati viventi.

Uno degli strumenti ottici più avanzati, infine, è il microscopio a campo vicino, che permette la visualizzazione di dettagli di dimensioni anche inferiori a quelle della lunghezza d'onda della luce impiegata. Si tratta di uno strumento di recente invenzione, messo a punto nel 1993. Il superamento del limite di risoluzione imposto dalla diffrazione è reso possibile dall’adozione di una sorta di filtro, una sonda costituita da uno schermo opaco recante un foro di dimensioni inferiori alla lunghezza d’onda della luce impiegata. Questa sonda lambisce la superficie del campione a poche decine di nanometri di distanza, raccogliendo soltanto la luce che attraversa il forellino. La risoluzione, in questo modo, scende a circa 50 nm.

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Microscopio elettronico

Lo schema di un microscopio elettronico è analogo a quello di un microscopio ottico: una sorgente produce la radiazione che incide sul campione e, passando attraverso specifici sistemi che fungono da lenti, va a comporre l’immagine ingrandita. La radiazione, tuttavia, non è di natura elettromagnetica, ma corpuscolare: si tratta infatti di un fascio di elettroni accelerati nel vuoto; le lenti convergenti, quindi, non sono di tipo ottico, ma “elettromagnetico”: sono costituite da campi elettrici e magnetici che, come è noto, sono in grado di modificare la traiettoria delle particelle cariche. Il tutto è protetto da un contenitore, all’interno del quale è praticato il vuoto. L’immagine viene composta su uno schermo fluorescente o, in alternativa, mediante sistemi fotografici o televisivi.

L’uso di elettroni in luogo di luce visibile porta notevoli vantaggi ai fini delle prestazioni dello strumento. La lunghezza d'onda minima della luce visibile, infatti, è di circa 400 nm (400 milionesimi di millimetro), mentre la lunghezza d'onda associata all'elettrone in questi strumenti può essere di soli 0,05 nm. Il potere di risoluzione del microscopio elettronico è pertanto notevolmente maggiore di quello dei microscopi ottici: si arrivano a percepire dettagli di qualche decimo di nm.

Esistono essenzialmente due tipi di microscopio elettronico: quello a trasmissione (Transmission Electron Microscope, TEM) e quello a scansione (Scanning Electron Microscope, SEM).

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TEM

In un TEM, gli elettroni che costituiscono il fascio attraversano completamente il campione. Questo, dunque, deve avere uno spessore estremamente ridotto, compreso tra 5 e 500 nm. Il potere d'ingrandimento arriva fino a un milione di volte. La migliore prestazione di un microscopio elettronico a trasmissione è stata ottenuta nel giugno 2003 con l’OAM (One Angstrom Microscope) in uso presso il Lawrence Berkeley National Laboratory negli Stati Uniti: lo strumento ha fornito un’immagine dei singoli atomi di litio di un campione di ossido di litio e cobalto (il litio è l’elemento più leggero dopo l’idrogeno e l’elio).

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SEM

A differenza del TEM, che può esaminare zone estese, un SEM analizza la superficie del campione porzione per porzione, mediante un “pennello” elettronico di sezione paragonabile alla risoluzione del microscopio (dell’ordine del nm). Gli atomi della superficie, colpiti dagli elettroni del fascio, emettono elettroni secondari (riflessi o diffratti) che, insieme agli elettroni trasmessi, vengono raccolti da un rivelatore e convertiti in segnali elettrici. Ogni punto del campione analizzato corrisponde a un pixel dello schermo televisivo, cosicché, man mano che il fascio elettronico scorre sul campione, sullo schermo si costruisce un'immagine completa. Un SEM ha fattore di ingrandimento pari a circa 100.000 e fornisce un'immagine tridimensionale molto dettagliata. Con i modelli più recenti, è possibile anche seguire l’evolversi di un processo dinamico, come la reazione di un campione a una variazione di temperatura, a una trasformazione chimica o a una sollecitazione meccanica.

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Altri microscopi elettronici

Nell’ambito della microscopia elettronica, sono state messe a punto diverse altre tecniche, che consentono prestazioni ancora migliori di quelle dei modelli tradizionali. Il microscopio elettronico a scansione e a trasmissione (Scanning Transmission Electron Microscope, STEM), ad esempio, combina le caratteristiche di un SEM con quelle di un TEM e ha potere risolutivo estremamente elevato, tale da arrivare a distinguere perfino gli atomi del campione.

Il microscopio analitico a sonda elettronica è dotato di un dispositivo che analizza i raggi X ad alta energia emessi da un campione bombardato da elettroni. Poiché i raggi X emessi permettono di identificare gli atomi da cui provengono, questo strumento fornisce non solo un'immagine ingrandita del campione come il microscopio elettronico convenzionale, ma anche informazioni sulla sua composizione chimica.

Una delle tecniche più recenti di microscopia elettronica è la cryo-ET, o tomografia elettronica. Combina la tecnologia della microscopia elettronica tradizionale con le tecniche criogeniche, per creare immagini tridimensionali di campioni biologici delle dimensioni degli organelli cellulari. Mediante un fascio di elettroni indirizzato sul campione mantenuto a bassissima temperatura, vengono catturate più immagini bidimensionali, successivamente elaborate da un computer in un’unica immagine tridimensionale. Uno dei principali vantaggi della cryo-ET consiste nel non richiedere coloranti o trattamenti inquinanti di fissazione del campione.

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Microscopi a sonda

I microscopi a sonda sono dotati di una punta metallica sensibile e sottilissima di diametro confrontabile alle dimensioni di un singolo atomo.

Il microscopio a effetto tunnel (Scanning Tunnel Microscope, STM), inventato nel 1981, sfrutta il fenomeno quantistico dell’effetto tunnel per fornire immagini dettagliate di sostanze conduttrici di elettricità. Tra la sonda e la superficie da ispezionare viene applicata una piccola differenza di potenziale; gli elettroni attraversano, per effetto tunnel, il ridottissimo spazio compreso tra la punta della sonda e l'oggetto, dando luogo a una corrente di tunnelling la cui intensità aumenta al diminuire della distanza tra la punta e gli atomi dell'oggetto. Il microscopio STM è dotato di un meccanismo di retroazione che mantiene costante la corrente, mentre la punta segue il profilo del campione. Le caratteristiche della superficie del campione sarebbero registrate come variazioni della corrente di tunnelling ma, attraverso i meccanismi di retroazione, vengono apprezzate come microspostamenti della punta della sonda.

Un altro tipo di microscopio a sonda è il microscopio a forza atomica (Atomic Force Microscope, AFM), che può analizzare anche campioni di materiale non conduttore. Quando la sonda di un AFM si muove lungo la superficie del campione, gli elettroni della sua punta metallica sono respinti dagli elettroni degli atomi del campione. I meccanismi di regolazione del microscopio aggiustano l'altezza della sonda rispetto alla superficie, in modo da mantenere costante la forza repulsiva tra le cariche negative. Un sensore registra i movimenti della sonda e li trasmette a un computer, che può così ricostruire un'immagine tridimensionale della superficie del campione.