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Introduzione

Reazione a catena della polimerasi o PCR In biologia molecolare, tecnica mediante la quale un frammento di acido desossiribonucleico (DNA) può essere riprodotto in un gran numero di copie. Tale tecnica fu messa a punto nel 1983 dal biochimico statunitense Kary B. Mullis e dal suo collaboratore Fred A. Faloona presso la Cetus Corporation di Emeryville, California. Mullis, per la sua scoperta, fu insignito nel 1993 del premio Nobel per la chimica.

Al momento della sua scoperta, la PCR (Polimerase Chain Reaction) non sembrava avere una rilevanza pratica; soltanto a partire dal 1991 cominciò a essere utilizzata ed è oggi largamente impiegata nei laboratori di tutto il mondo. La PCR rende più rapido l’ottenimento di copie di un frammento di DNA in esame, che in precedenza veniva affidato alla tecnica della clonazione.

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Meccanismo della PCR

La reazione a catena della polimerasi si basa sullo stesso meccanismo di duplicazione del DNA che si verifica all’interno delle cellule viventi. La struttura del DNA è formata da due filamenti tra loro complementari; durante il processo di duplicazione, i due filamenti si separano e un enzima specifico, denominato polimerasi, produce una copia di ciascuno, utilizzandolo come stampo. La polimerasi procede appaiando un nucleotide complementare a ogni nucleotide di un filamento; in tal modo si formano due catene di DNA identiche a quella iniziale. Normalmente, il processo si verifica in una cellula durante la mitosi, ossia durante il processo di divisione cellulare che porta alla formazione di due cellule figlie, geneticamente identiche alla madre. Per lo svolgimento della PCR è necessaria la presenza dell’enzima polimerasi, di una riserva di nucleotidi liberi e di un breve filamento di nucleotidi, purificato in laboratorio, che ha la funzione di innescare la reazione e prende il nome di primer o iniziatore oligonucleotidico.

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Fasi di esecuzione

La reazione a catena della polimerasi avviene in tre fasi. Nella prima, denominata denaturazione, il frammento di DNA viene riscaldato a una temperatura di 90-95 °C per 30 secondi, allo scopo di indurre la separazione dei due filamenti complementari che lo compongono. Nella seconda fase, detta annealing o attacco, la temperatura viene mantenuta per 20 secondi a 55 °C, il che determina il legame tra i primers con i due filamenti di DNA. Nella terza fase, la polimerizzazione, la temperatura viene innalzata a 75 °C e la polimerasi copia con grande rapidità il DNA, aggiungendo a ciascun filamento i nucleotidi complementari. Queste tre fasi costituiscono un ciclo della PCR, che si realizza in meno di 2 minuti. Teoricamente, un ciclo potrebbe ripetersi in modo indefinito; in realtà, i nucleotidi liberi, la polimerasi e i primers devono essere rinnovati circa ogni 30 cicli. In 30 cicli, che si svolgono nell’arco di meno di tre ore, si può ottenere un miliardo di molecole di DNA.

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La polimerasi Taq

L’enzima polimerasi, utilizzato nei primi esperimenti della reazione a catena della polimerasi, risultava facilmente degradato dal calore; ciò costringeva i ricercatori ad aggiungere una certa quantità di enzima per ciascun ciclo, in modo da sostituire le molecole enzimatiche inattivatesi nel corso della reazione. Attualmente, i ricercatori dispongono di una versione termostabile della polimerasi denominata Taq che non subisce l’effetto del calore. All’inizio tale enzima veniva estratto da Thermus aquaticus, un batterio termofilo che vive nelle pozze di acqua calda del parco nazionale di Yellowstone. La polimerasi Taq viene attualmente ottenuta in laboratorio da batteri modificati geneticamente (vedi Organismi transgenici). Durante l’esecuzione della PCR è necessario impedire che la miscela di reazione venga contaminata con frammenti di DNA diversi da quelli che si vogliono moltiplicare.

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Applicazioni della PCR

Poiché per l’esecuzione della PCR sono necessarie quantità di DNA molto piccole, essa è divenuta uno strumento largamente impiegato in vari ambiti. In particolare, trova applicazione nella biologia, nella medicina diagnostica e nella medicina legale.

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Gli studi biologici

In biologia, la PCR ha permesso di chiarire la funzione di molti geni, di eseguire mappe genetiche (cioè di individuare la sequenza e la distanza fra geni) e studi sui processi evolutivi.

Nello studio della funzione dei geni, si utilizza la PCR per ottenere numerose copie di uno stesso gene e rendere più facili le indagini successive.

Nella realizzazione di mappe genetiche, la PCR permette di copiare determinate regioni del DNA umano; essa è di fondamentale importanza per la realizzazione del Progetto Genoma Umano, che si propone la mappatura dell’intero patrimonio genetico della specie umana.

Negli studi sui processi evolutivi, la PCR si è rivelata utile per esaminare il DNA di insetti fossili rimasti imprigionati nell’ambra; in tali organismi, il DNA ha in larga parte perso la sua struttura originaria, ma si sono conservate molecole sufficienti dell’acido nucleico per potere realizzare la PCR e ottenere quindi molte copie di quei frammenti; è possibile così confrontare, ad esempio, il patrimonio genetico degli insetti fossili con quello degli insetti attuali per ipotizzare quali cambiamenti possono essere avvenuti nel corso dell’evoluzione.

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Le indagini mediche

In medicina, la PCR risulta un utile strumento nella diagnosi prenatale. I campioni di DNA del feto prelevati mediante amniocentesi possono attualmente essere analizzati nel giro di un’ora, mentre prima era necessario coltivare cellule fetali su un mezzo di coltura speciale per diverse settimane, prima di riuscire a effettuare indagini biochimiche. La PCR può essere anche applicata nel campo della fecondazione in vitro, per determinare se embrioni umani di un’ora di vita siano portatori di anomalie, prima di procedere all’impianto degli embrioni stessi nell’utero materno.

Altre applicazioni della PCR riguardano l’identificazione di virus, batteri e cellule cancerogene all’interno di tessuti umani; ad esempio, con la PCR può essere identificato il virus Ebola nell’organismo di un paziente. Può anche essere impiegata per identificare tipi cellulari specifici di uno stesso organismo (in tal caso, si procede con una variante della PCR denominata PCR in situ).

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Le ricerche di medicina legale

Nel campo della medicina legale, la tecnica della PCR rende oggi possibile l’identificazione di criminali; infatti, l’analisi di frammenti di DNA di un individuo, derivanti da piccole quantità di tessuti (come sangue, pelle, peli, liquido seminale) trovate sul luogo di un delitto, permettono di identificarlo in modo inequivocabile. Con la cosiddetta “prova del DNA” si possono scagionare definitivamente o incriminare gli individui sospettati.

La tecnica della PCR viene anche eseguita nel corso di indagini di polizia per scoprire il responsabile della contaminazione di acque con residui industriali e altre sostanze. Si procede marcando con piccole quantità di DNA noto i residui delle lavorazioni industriali (come sostanze esplosive, derivati del petrolio e pesticidi) di ciascun possibile produttore; queste “etichette” di DNA possono essere recuperate nei fanghi presenti nelle acque contaminate e venir riprodotte un gran numero di volte mediante la PCR, per essere studiate. Confrontando il DNA ritrovato nei campioni con liste in cui sono elencate tutte le “etichette” di DNA attribuite a ciascun produttore, è possibile risalire a quello che è responsabile della contaminazione.